【摘要】 目的建立快速、灵敏的奥洛他定在人体内血药浓度的测定方法，并研究10名健康志愿者单剂量口服5 mg盐酸奥洛他定片后的药动学特点。方法 分别于给药前及口服给药后0.25、0.5、0.75，1、1.5，2、3、4、6、8、10、12、16、24、48 h采集肘静脉血，用高效液相色谱-质谱法测定血浆药物浓度，并采用DAS程序计算主要的药动学参数。结果 单剂量口服盐酸奥洛他定片5 mg后，其血药质量浓度—时间曲线拟合符合二室模型，主要药动学参数分别为：T1/2 (6.55±2.50)h、Tmax(0.98±0.32)h、Cmax(53.75±19?76)μg·L-1、AUC0-48(159.54±60.94)μg·h·L-1、AUC0-∞(161.79±61.19) μg·h·L-1。结论 建立的奥洛他定人体内血药浓度测定方法灵敏、可靠、简便;国产盐酸奥洛他定片单剂量给药后在健康人体内耐受良好。
【关键词】 盐酸奥洛他定片;高效液相色谱-质谱法;阿米替林;药动学
Abstract:Objective To develop a rapid and sensitive HPLC-MS method for the analysis of olopatadine in human plasma,and study on the pharmacokinetics characteristics of olopatadine hydrochloride tablets after a single oral dose of 5 mg in healthy volunteers.Methods A single oral dose of 5 mg olopatadine hydrochloride tablets was given to 10 healthy volunteers.Blood samples were taken before dosing and at 0.25,0.5,0.75,1,1.5,2,3,4,6,8,10,12,16,24,48 h after a single oral of 5 mg.A HPLC-MS method was used to assay the concentration of olopatadine in plasma.The pharmacokinetic parameters were evaluated with DAS program.Results The concentrations of olopatadine in plasma were fitted with a two-compartment model.The main pharmacokinetic parameters by oral adminstration were as follow: T1/2(6.55±2.50)h，Tmax(0.98±0.32)h，Cmax (53.75±19.76)μg·L-1，AUC0-48(159.54±60.94)μg·h·L-1，AUC0-∞(161.71±61.19) μg·h·L-1. Conclusion The analytical method appeared to be accurate,sensitive and convenient.Olopatadine tablets can be well tolerated in healthy Chinese volunteers after a single dose.
Key words: olopatadine hydrochloride tablet; HPLC-MS/MS; amitriptyline; pharmacokinetics
盐酸奥洛他定(olopatadine hydrochloride)是一种高选择性的外周H1受体阻断剂，具有抗组胺和抗变态反应活性，属第二代非镇静性抗组胺药，于2000年12 月在日本被批准用于治疗过敏性鼻炎、慢性荨麻疹、湿疹性皮炎、瘙痒、皮肤瘙痒症、寻常性牛皮癣和多形性渗出性红斑。本文参照文献[1]对北京嘉林药业股份有限公司研制生产的盐酸奥洛他定片进行人体药动学研究，为临床用药提供依据。
1材料与方法
1.1药品与试剂
盐酸奥洛他定片(北京嘉林药业股份有限公司，5 mg/片,批号：20080901，失效期2010年8月);盐酸奥洛他定对照品(北京嘉林药业股份有限公司，批号：080801，质量分数99.8%);内标物阿米替林对照品(批号：100518-200401，中国药品生物制品检定所);乙腈(色谱纯，默克公司);甲酸铵(质谱纯，美国Sigma公司);水为重蒸去离子水;甲酸(色谱级，美国迪马公司);醋酸乙酯、二氯甲烷(分析纯，均由广州化学试剂厂提供)。
1.2仪器
Agilent 1100高效液相色谱仪系统(G1313A自动进样器，G1311A自动调配泵G1316A可调柱温恒温箱，Agilent LC/MSD Trap XCT质谱仪，Agilent色谱化学工作站)，XW-80A旋涡混合器(原上海医科大学仪器厂)，BP110S型电子分析天平(瑞士Sartorius)，MIKR012-24型高速离心机(美国Micro12-24)，111型真空干燥箱(德国MMM-Group)。
1.3受试者选择
试验前试验方案经医院伦理委员会审批，志愿者本人签署知情同意书后，进行体格检查，胸透、心电图、血压、血尿常规及肝肾功能等各项指标均正常者入选为受试者。受试者10人，男女各半，平均年龄为(22±3)岁，受试者禁食过夜(至少10 h)，于次日早晨7：30，200 mL温开水送服盐酸奥洛他定片5 mg，给药后2 h内不得饮水，4 h后进食统一低蛋白、低脂肪标准餐，试验期间不做剧烈运动。
1.5血样采集与ADR监护
10例受试者均于用药前在前臂静脉安置留置针抽血，用药前采空白血约4 mL，再分别于给药后0.25、0.5、0.75，1、1.5，2、3、4、6、8、10、12、16、24、48 h采集肘静脉血5.0 mL， 置肝素化的试管中，3 000 r/min离心10 min分离血浆，置-20 ℃下冰柜储存备用。整个试验过程均在医师和护士监护下进行，并于给药后不同时间监测受试者的反应，及时处理和记录试验过程中发生的不良反应。试验期间禁用其他药物及含咖啡因类饮料、烟和酒。
1.6样品测定
1.6.1色谱条件色谱柱：Agilent Eclipse plus C18(4.6 mm×150 mm，3.5 μm);流动相：甲醇-水(含0.005 mol·L-1甲酸铵和质量分数0.1%甲酸)(体积比95∶5);流速：0.5 mL·min-1;柱温：40 ℃。质谱条件：电喷雾电离源(ESI)，正离子化，扫描方式为选择性离子监测，奥洛他定m/z 338.3→165.2，阿米替林m/z 278.1→91.0，毛细管电压4 000 V，喷雾气压力50 Pa，干燥气流速10 L·min-1，干燥气温度350 ℃，奥洛他定和阿米替林碰撞能量均为28 U，裂解电压均为135 V，四级杆捕捉时间均为0.2 s，电子倍增器电压200 V，进样量为20 μL。
1.6.2血样的处理取含药血浆0.5 mL置2 mL的带塞离心管中，加入200 μg·L-1的阿米替林甲醇溶液50 μL，快速振荡5 s，加乙腈(含质量分数1%甲酸)0.5 mL，密塞，振荡15 s， 16 000 r·min-1离心5 min，吸取上清液转移至10 mL带塞磨口锥形玻璃离心管，加醋酸乙酯-二氯甲烷(体积比4∶1)混合液 3 mL，密塞，旋涡振荡1 min，3 000 r·min-1 离心5 min，吸取有机层置3 mL的带塞磨口锥形玻璃离心管内，
42 ℃真空干燥至干。进样前加入流动相混合溶液200 μL，快速振荡10 s使残渣溶解，3 500 r·min-1离心5 min，吸取上清液20 μL进样。
1.6.3标准溶液的配制精确称取盐酸奥洛他定、盐酸阿米替林对照品各若干(分别含奥洛他定、阿米替林各10 mg)，分别置10 mL容量瓶中，用甲醇溶解定容至刻度，即配制成质量浓度为1 g·L-1的贮备液，贮存于4 ℃冰箱避光保存备用。试验前按试验所需用流动相稀释成相应浓度的标准工作液。另配制质量浓度为200 μg·L-1的内标阿米替林甲醇溶液。
1.6.4方法专属性分别取6名受试者的空白血浆各0.5 mL，在“1.6.1”色谱条件下测得的6种来源空白血浆、含药血浆及受试者给药后血样的HPLC-MS色谱图分别见图1。奥洛他定、阿米替林的出峰时间分别约为2.99 min和3.15 min。结果表明，空白血浆中内源性物质不干扰奥洛他定及内标阿米替林的测定。
1.6.5标准曲线制备取空白血浆1 mL，分别加入质量浓度为2、5、10、50、100、200、500和1 000 μg·L-1的奥洛他定对照品溶液50 μL，振荡5 s，使血浆药物质量浓度分别相当于0.2、0.5、1、5、10、20、50和100 μg·L-1，然后按“1.6.2”项处理。在“1?6?1”项下色谱条件进行HPLC-MS分析，以奥洛他定峰面积与内标峰面积之比(y)为纵坐标，以血浆奥洛他定质量浓度(x)为横坐标， 权重系数为1/x2，血浆中奥洛他定质量浓度在0.2～100 μg·L-1范围呈良好的线性关系，典型方程为：y=0.3038x+0?0032，r=0.995 6(n=8)。血浆样品奥洛他定定量下限质量浓度为0.2 μg·L-1(S/N>10)，平行对质量浓度为0.2 μg·L-1的5个含药血浆样品处理后进行色谱分析，RSD为6.36%。
1.6.6精密度和回收率按“1.6.5”项方法分别配制低(0.5 μg·L-1)、中(20 μg·L-1)和高(50 μg·L-1)质量浓度的奥洛他定血浆溶液各15份，分为3批，每批5份，并于每批的标准曲线同时进行，依“1.6.2”项处理后取20 μL进样，计算质控样品的测得浓度，与配制浓度对照，求得本法的准确度和精密度。同法以空白血浆，除不加标准系列溶液和内标外，按“1.6.5”项方法处理后，再加入相应浓度的奥洛他定和阿米替林，残留物以流动相200 μL溶解，离心后取20 μL进样，以每一浓度两种处理方法的峰面积比值计算提取回收率。结果见表1。日内精密度测得值/(μg·L-1)RSD/
1.6.7稳定性试验按“1.6.5”方法分别配制低(0.5 μg·L-1)、中(20 μg·L-1)、高(50 μg·L-1)的质控血浆样品，每个浓度18个样品分析，分成3组，分别在25 ℃(0 h、24 h)、-20 ℃冻融(冻融1次、3次)和长期-20 ℃冻存(1 d、60 d)下进行质谱测定，结果RSD均在15%(低质量浓度RSD在20%)内。
1.7质量控制
每批样品检测前均先制作随行标准曲线，测定样品时，随行检测低(0.5 μg·L-1)、中(20 μg·L-1)、高(50 μg·L-1)质量浓度的质控样本(制备方法同“1?6.5”)。结果随行标准曲线线性良好，低、中、高3个浓度质控样品的偏差均在15%内，符合体内药物分析要求，本试验血浆样品的测定结果准确、可靠。
1.8数据处理
绘制受试者口服盐酸奥洛他定片后的血药质量浓度—时间曲线。将各受试者给药后各时间点血浆中奥洛他定的浓度数据输入计算机，用上海宏能软件有限公司编写的DAS程序对血药质量浓度—时间数据进行拟合，求算有关药动学参数。
2结果
2.1平均血药质量浓度—时间曲线
10名健康志愿者单剂量口服盐酸奥洛他定片5 mg后的平均血药质量浓度—时间曲线见图2。
2.2有关药动学参数
将血药质量浓度—时间数据用DAS程序处理，结果表明，10名健康志愿者的药—时曲线符合以权重为1/C拟合的静脉给药二室模型。Cmax和Tmax采用实测值，AUC0-24采用梯形面积法计算，AUC0-∞=AUC0-24+C24/ke计算，其主要药动学参数见表2。
2.3不良反应情况
10名受试者在试验过程中，均未出现不良反应，试验后进行体格复查，胸透、心电图、血压、血尿常规及肝肾功能等各项指标均正常。[PSd182;S*2〗图210名健康志愿者单剂量口服盐酸奥洛他定片5 mg后的平均血药质量浓度—时间曲线 Figure 2Mean plasma concentration-time of olopatadinehydrochloride tablets after a single oral dose of5 mg in 10 healthy volunteers 表210名健康志愿者口服给药后的主要药动学参数 3讨论
本文曾采用醋酸乙酯、乙醚、三氯甲烷以及醋酸乙酯-二氯甲烷(体积比4∶1)作为提取液，通过比较发现醋酸乙酯-二氯甲烷(体积比4∶1)混合提取液提取率最高，杂质也较少，故采用此混合提取液。本文建立的用离子肼质谱仪检测的方法，定量检测限达到0.05 μg·L-1，满足人体药动学研究要求。
文献[3]中使用地氯雷他定作为内标物，笔者经过对地氯雷他定、卢帕他定、阿米替林、西替利嗪等药物的比较发现，阿米替林与奥洛他定提取条件相似，且出峰时间相近，内源性物质不干扰，因此，本文采用阿米替林作为内标物。本文检测定量限为0.2 μg·L-1,低于文献[3]报道的1 μg·L-1;采用醋酸乙酯-二氯甲烷(体积比4∶1)混合溶剂作为提取剂，较文献[2]所用固相萃取方便快捷。本方法操作简单、快速，检测结果准确、灵敏度高、重复性好，可作为临床常规奥洛他定的血药浓度监测及其药动学的研究。
【参考文献】
[1] KAZUHIRO F,HIRKSHI M,HIROYUKI K .Determination of olopatadine,a new antiallergic agent,and its metabolites in human plasma by high-performance liquid chromatography with electrospray lonization tandem mass spectrometry[J].J Chromatogr Biomed Sci Appl,1999,731(2):345-352.
[2] 梁伟，周辉，刘东阳，等.HPLC-MS/MS联用技术定量测定人血浆中奥洛他定浓度[J].质谱学报,2006,27(4):193-195.
[3] 陈伟力，戴佩信，汪红，等.液相色谱-串联质谱法测定人血浆中奥洛他定的浓度[J].中国临床药学杂志，2009，18(6):338-341.
